制備型反相高效液相色譜 (HPLC) 可分離高純度化合物，被廣泛應(yīng)用于化學(xué)、制藥、生物技術(shù)和生物化學(xué)行業(yè)。由于其分離純度高，在小分子藥物化合物、寡核苷酸、多肽、天然產(chǎn)物的藥物合成中成為必不可少的純化手段。

圖1：HPLC純化在藥物中的案例

HPLC餾分是什么？

HPLC餾分是含有水和極性有機(jī)溶劑（如乙腈/水或甲醇/水），為了更好的分離雜質(zhì)，反向HPLC流動(dòng)相中通常會(huì)添加0.1%三氟乙酸（TFA）。

1、HPLC餾分濃縮面臨的問題

藥物發(fā)現(xiàn)中，為了建立文庫或通過高通量篩選確定合適的靶標(biāo)，藥物合成后需要進(jìn)行大量純化、篩選、分析工作，每天需要處理大量的HPLC餾分，前處理所花費(fèi)的時(shí)間高達(dá)61%。

處理HPLC餾分濃縮時(shí)可能出現(xiàn)的瓶頸：

1. 藥物種類多變，樣品體積、樣品容器、溶劑比例不一；

2. 樣品量巨大，處理時(shí)間長；

3. 甲醇/乙腈的沸點(diǎn)較低，在蒸發(fā)過程容易產(chǎn)生暴沸；

4. 直接濃縮干燥很難得到干燥蓬松的最終產(chǎn)物。

2、提升效率的關(guān)鍵點(diǎn)

新藥研發(fā)就是與時(shí)間賽跑，提高效率就是節(jié)省金錢。

因此，提高樣品平行濃縮的效率，就必須解決樣品前處理中高通量和自動(dòng)化的問題，在藥物發(fā)現(xiàn)CRO企業(yè)中尤為重要。 

高通量

為滿足藥物高通量篩選要求，Genevac HT-12高端智能的蒸發(fā)系統(tǒng)提供高通量處理量，同時(shí)處理上百個(gè)到上千個(gè)樣品，上百種轉(zhuǎn)子可選，滿足各類化合物體積不一和高通量的濃縮需求。

樣品完整性

現(xiàn)代藥物化學(xué)中，保持樣品的質(zhì)量和完整性非常重要。Dri-pure防暴沸技術(shù)，利用梯度真空和高轉(zhuǎn)速的原理，有效防止低沸點(diǎn)溶劑暴沸，避免樣品交叉污染。（點(diǎn)擊查看往期內(nèi)容：實(shí)力解析：如何防止混合溶劑“碰撞”導(dǎo)致的樣品損失）

自動(dòng)化

以下是實(shí)驗(yàn)室一般處理流程及Genevac的處理流程的對比圖——

Genevac通過SampleGenie技術(shù)簡化實(shí)驗(yàn)流程，直接將樣品濃縮到小瓶中，避免樣品轉(zhuǎn)移帶來的損失，并可以節(jié)約濃縮時(shí)間，以方便后續(xù)處理。

圖2：實(shí)驗(yàn)室一般處理流程

圖3：Genevac處理流程簡化方案

3、如何從HPLC餾分中高效得到干燥蓬松的最終產(chǎn)物？

藥物研發(fā)實(shí)驗(yàn)室的要求是將樣品干燥成蓬松的粉末狀，以便準(zhǔn)確稱量樣品、二次取樣、復(fù)溶和儲(chǔ)存，因此，冷凍干燥是實(shí)驗(yàn)的理想技術(shù)。但是常規(guī)的冷凍干燥系統(tǒng)一方面處理時(shí)間長，另一方面難以處理有機(jī)溶劑，因?yàn)橛袡C(jī)溶劑很容易產(chǎn)生暴沸，并因此損壞真空泵，造成樣品損失。而使用傳統(tǒng)的蒸發(fā)技術(shù)難以得到蓬松的樣品。

LyoSpeed?技術(shù)

快速凍干法（LyoSpeed?）是一個(gè)兩全其美的方法：一種快速，能夠得到徹底干燥和蓬松樣品的方法。該方法同時(shí)也適用于難以干燥的樣品，尤其適用HPLC餾分干燥。利用先濃縮后凍干的程序，蒸發(fā)程序包含以下階段：

1) 使用Dri-pure防暴沸技術(shù)& 40mbar的壓力下去除部分大部分有機(jī)溶劑；

2) 自動(dòng)排液放出有機(jī)溶劑（ADD冷阱自動(dòng)排液功能）；

3) 真空度降至8mbar，快速蒸發(fā)大部分水；

4) 關(guān)閉紅外燈，極低的真空度下使樣品冷凍變成固態(tài)；

5) 在全真空下加熱一定時(shí)間以加速升華；

6) 最后在全真空不加熱的條件下直至樣品完全冷凍干燥。

圖4：快速凍干過程

Lyospeed法比只用凍干的方法速度更快，同時(shí)比只用蒸發(fā)的方法得到更加干燥和蓬松的樣品。

4、案例分享

將15ml 0.01M 布洛芬鈉鹽溶液溶解在40%乙腈水混合物中并裝入20ml閃爍瓶，使用Lyospeed技術(shù)平衡濃縮和凍干過程，在HT系列溶劑蒸發(fā)工作站進(jìn)行快速凍干。下圖顯示傳統(tǒng)離心濃縮樣品與快速凍干樣品之間的差異，快速凍干的樣品更加蓬松，更利于樣品的復(fù)溶。

圖5：傳統(tǒng)蒸發(fā)結(jié)果  

圖6：快速凍干結(jié)果

Lyospeed技術(shù)兼容EZ-2 4.0 Elite離心濃縮系統(tǒng)和Genevac HT 3i系列溶劑蒸發(fā)工作站，由足夠好的無油真空泵、自動(dòng)除霜和排液的冷阱以及一個(gè)靈活、可編輯方法的軟件組成。

EZ-2 4.0 Elite離心濃縮系統(tǒng) 

HT 3i系列溶劑蒸發(fā)工作站

參考文獻(xiàn)：

Genecac_TechArticle_Drying of Problematic Purification Samples by Lyophilisation in a Centrifugal Evaporator - with “Fluffy” Results