2020年版中國藥典收載了5種復(fù)方氨基酸注射液、9種多肽類藥物及1種中藥品種，均需要采用氨基酸分析方法測定藥品中氨基酸含量或氨基酸組成。為了指導(dǎo)藥典標準執(zhí)行過程中如何選擇適宜的方法，國家藥典委員會委托中檢院牽頭承擔(dān)完成了“藥品中氨基酸分析法的建立課題”，擬定了中國藥典氨基酸分析指導(dǎo)原則，填補之前藥典中關(guān)于選擇測試方法的空白。

                    圖1：各國藥典介紹的氨基酸分析方法

問題來了

這么多的檢測方法應(yīng)該如何選擇？

蛋白質(zhì)和多肽的氨基酸分析，需要將樣品先水解成游離的氨基酸才能進行分析。由于氨基酸本身并沒有發(fā)色集團或熒光基團，所以游離氨基酸通常需要衍生化才能測定。藥品中氨基酸測定常用方法一共有6種，分別是：

① 柱前PITC衍生氨基酸測定法；

② 柱前AQC衍生氨基酸測定法；

③ 柱前OPA和FMOC衍生氨基酸測定法；

④ 柱前DNFB衍生氨基酸測定法；

⑤ 柱后茚三酮衍生氨基酸鋰離子交換系統(tǒng)測定法；

⑥ 柱后茚三酮衍生氨基酸鈉離子交換系統(tǒng)測定法。

按照衍生順序可分為柱前衍生和柱后衍生。

柱前衍生法

原理：根據(jù)氨基酸與衍生試劑反應(yīng)，生成有紫外吸收的衍生物，后經(jīng)反相液相色譜分離后用紫外檢測器在一定波長處檢測，在一定的濃度范圍內(nèi)其響應(yīng)值與氨基酸濃度成正比；

優(yōu)點：對儀器配置要求不高，實驗成本低。

缺點：某些衍生物不穩(wěn)定，無法定量，分離效果一般。

柱后衍生法

原理：通過調(diào)節(jié)系統(tǒng)pH值及離子強度，采用鋰/鈉離子交換系統(tǒng)，實現(xiàn)離子交換色譜柱對混合氨基酸的分離，經(jīng)離子交換色譜分離的氨基酸與茚三酮反應(yīng)，一級氨基酸生成紫色化合物，在570nm波長處有最大吸收。二級氨基酸（如脯氨酸）生成黃色化合物，在440nm波長處有最大吸收。在440nm和570nm波長處分別檢測，在一定的濃度范圍（20～500pmol）內(nèi)，氨基酸衍生化產(chǎn)物的吸光度與氨基酸濃度成正比；

優(yōu)點：自動化程度高，不易受基質(zhì)干擾。

缺點：針對《氨基酸分析指導(dǎo)原則草案公示稿（第二次）》提到的采用柱后茚三酮衍生氨基酸鋰離子交換法，分析時間長，異亮氨酸和亮氨酸間的分離難以達到要求。改善建議采用溫度梯度可以改善分離效果。

Pickering |氨基酸分析解決方案

1、Pickering參照歐洲藥典8.0，提供了完整的氨基酸分析解決方案——

方案包括Onyx-PCX 柱后衍生儀、色譜柱和保護柱、緩沖液和茚三酮衍生試劑。

Pickering Onyx-PCX可以修改運行條件，執(zhí)行溫度梯度程序，縮短運行時間加速氨基酸分離,符合歐洲藥典8.0的系統(tǒng)適用性要求,（亮氨酸和異亮氨酸分離度要大于1.5）。

                           表1：歐洲藥典8.0參考指南

2、分析條件：

色譜柱：高效鈉離子交換柱 4.6*110mm，貨號1154110T；

流速:0.6mL/min；

流動相:見表2；

進樣體積:50ul；

  表2：HPLC梯度程序（115411T）

3、柱后衍生條件：

柱后衍生系統(tǒng):Onyx PCX；

反應(yīng)器體積:0.5mL；

試劑:Trione®茚三酮 ；

反應(yīng)溫度:130oC；

柱溫:見表3；

流速:0.3 mL/min；

檢測波長:UV/Vis 570nm一級氨基酸；440nm二級氨基酸。

   表3：柱溫程序

圖1：歐洲藥典8.0方法分析氨基酸的鈉柱色譜圖一 _(濃度3 ug/mL, 進樣體積50 uL)

圖2：氨基酸分析鈉柱色譜圖，以歐洲藥典8.0方法計算系統(tǒng)適應(yīng)性檢查 _(參考表1).

Proline – 1.2 ug/mL; Isoleucine – 3 ug/mL; Leucine – 3 ug/mL; Ammonia – 0.12 ug/mL. 進樣體積50 uL.

4、結(jié)論：

今年3月份發(fā)布的針對《氨基酸分析指導(dǎo)原則草案公示稿（第二次）》中，以歐洲藥典為參照,填補了我國2020版藥典之前對氨基酸分析指導(dǎo)意見的空白，詳細的闡述了幾個常用方法的原理以及特點。Pickering參照歐洲藥典8.0，提供完整解決方案，HPLC+Onyx PCR 即可實現(xiàn)藥典中提到的柱后茚三酮衍生氨基酸鋰離子交換系統(tǒng)測定法和柱后茚三酮衍生氨基酸鈉離子交換系統(tǒng)測定法，實現(xiàn)方法擴增。

引用：氨基酸分析指導(dǎo)原則草案公示稿（第二次）

關(guān)于Pickering Laboratories

美國Pickering Laboratories公司是全球?qū)I(yè)提供人工測試體液和柱后衍生化學(xué)試劑、色譜柱、分析方法等柱后衍生分析整體解決方案的機構(gòu)，其不斷創(chuàng)新及良好的信譽被眾多的美國政府機構(gòu)如EPA、ATF、FDA、AOAC和世界知名的廠商所認可。